La rana llorona, Physalaemus biligonigerus (Cope, 1861), se distribuye continuamente en el sur de la región neotropical, a través de biomas contrastantes como el Chaco, Yungas, Pampas, Espinal, Sabanas Uruguayas y la Selva Atlántica. Además de su amplia distribución geográfica, esta especie se caracteriza por una notable variabilidad en tamaño y patrones de coloración dorsal, lo que evidencia una marcada diversidad fenotípica. Con el objetivo de evaluar la estructura poblacional de esta especie y la diversidad genética de sus poblaciones, analizamos datos provenientes de dos tipos de marcadores moleculares. Analizamos datos de secuencias de fragmentos de los genes mitocondriales Citocromo Oxidasa I (577 pb) y 16S (534 pb); y datos genómicos (~4700 SNPs generados mediante la técnica de ddRADseq) de 240 ejemplares provenientes de todo el rango de distribución conocido de la especie. Los resultados obtenidos a partir de ambos sets de datos revelaron una alta diversidad genética con reconocible estructuración geográfica. No obstante, se observaron algunas discordancias entre los patrones revelados por los marcadores mitocondriales con respecto a los obtenidos con los marcadores nucleares. A partir de los marcadores mitocondriales se identificaron seis clusters genéticos. La historia demográfica de dichos clusters, evaluada mediante test de neutralidad (D de Tajima D y F de Fu), no mostraron valores significativos, lo que sugiere que las poblaciones se mantuvieron estables. En cuanto a los datos genómicos, se detectaron tres poblaciones diferenciadas: una población distribuida en Uruguay, el estado de Rio Grande do Sul (Brasil), la provincia de Misiones y el norte de Corrientes (Argentina), una segunda población distribuída desde el centro de Argentina y en gran parte de Paraguay, y la tercera población distribuida en el norte de Paraguay y los estados brasileños de Mato Grosso y Mato Grosso do Sul. En las zonas de contacto o cercanías geográficas entre estas tres poblaciones se observa la presencia de algunos individuos híbridos, sugiriendo la posible ocurrencia de flujo génico actual y/o pasado entre ellas. La distribución geográfica de los quiebres genéticos podría ser explicada por la presencia de grandes ríos que se interponen entre estos grupos, en particular los Ríos Paraná y Apa, los cuales podrían haber funcionado como barreras al flujo génico. No obstante, serán necesarios análisis basados en modelos coalescentes para corroborar esta hipótesis, así como para inferir cuáles fueron los procesos que modelaron la distribución actual de la variabilidad genética en P. biligonigerus.