La soja (Glycine max L.) es uno de los cultivos de mayor importancia económica en Uruguay. La soja se ve afectada por varios patógenos fúngicos, incluidas las especies del género Diaporthe que causan el cancro del tallo de la soja (CTS), enfermedad que reduce el rendimiento a nivel mundial. Los principales patógenos que causan el CTS son Diaporthe aspalathi, D. caulivora, D. masirevicii, D. miriciae y D. longicolla (Mena et al. 2020; Mena et al. 2024). Los síntomas de la enfermedad son similares entre las especies de Diaporthe y consisten en lesiones necróticas de color rojizo-marrón en los tallos. La similitud entre las características morfológicas y los síntomas de la enfermedad entre las especies constituyen un desafío para el diagnóstico convencional de enfermedades. El presente estudio se llevó a cabo para detectar y cuantificar especies de Diaporthe asociadas a la CTS en Uruguay mediante qPCR multiplex. Se diseñaron cuatro conjuntos de cebadores y sondas TaqMan específicos de cada especie basándose en las secuencias del gen del factor de elongación de la traducción 1-alfa (tEF1a) para las especies: D. aspalathi, D. caulivora, D. miriciae y D. longicolla. La especificidad y eficiencia de los conjuntos cebador-sonda se probaron utilizando productos de PCR y ADN genómico de cultivos puros de especies de Diaporthe. Además, se evaluó el ensayo de qPCR múltiplex en plantas de soja inoculadas con una o más especies de Diaporthe. Nuestros resultados indican que estas especies de Diaporthe se pueden detectar y cuantificar de forma independiente y en paralelo con un ensayo de qPCR múltiple. Por lo tanto, nuestro ensayo qPCR podría ser una herramienta útil para el diagnóstico de D. aspalathi, D. caulivora, D. miriciae y D. longicolla, así como para diseñar estrategias para controlar la enfermedad del CTS.