La paratuberculosis (PTBC) es una enfermedad entérica, crónica de distribución mundial. Es producida por Mycobacterium avium subesp. paratuberculosis (MAP) y afecta rumiantes domésticos y silvestres. Debido a las características de la infección es difícil detectar a MAP o la respuesta inmune contra el mismo. En las fases más avanzadas la enfermedad se caracteriza por diarrea crónica, pérdida de peso, hipoproteinemia y muerte. El objetivo de este estudió fue evaluar el uso de qPCR para la detección de MAP en dos tambos bovinos del departamento de Colonia con situaciones contrastantes respecto de la ocurrencia de casos clínicos de PTBC. Para esto, se determinó por ELISA la seroprevalencia real de dos establecimientos lecheros (1 y 2). Luego, se aplicó PCR y qPCR para detectar al microorganismo en materia fecal y ambiente. Por otro lado, en el establecimiento 2 se realizó un estudio longitudinal durante dos meses en que se tomaron muestras de materia fecal y leche de animales seropositivos para detectar MAP por coloración de Ziehl-Neelsen (ZN), PCR y qPCR. Durante el mismo periodo se tomaron muestras ambientales y de tanque de leche y se realizó PCR y qPCR. Se determinó la concordancia entre qPCR, PCR y coloración de ZN, y estableció un punto de corte de qPCR que permitió predecir los resultados cualitativos de las pruebas de PCR y coloración de ZN. La seroprevalencia real en el establecimiento 1 es de 0% y en el establecimiento 2 de 7%. Utilizando qPCR se puedo detectar MAP en el establecimiento 1 en una muestra de materia fecal y en una ambiental. En el establecimiento 2, se detectó MAP en la materia fecal y en muestras ambientales en el 68% y 80%, respectivamente. Al comparar las técnicas utilizadas, hubo concordancia mínima entre PCR y qPCR, concordancia moderada entre PCR y ZN y falta de concordancia entre ZN y qPCR. Se determinó el punto de corte óptimo de la qPCR que se asoció con resultado positivo de PCR de 258 copias/mg de materia fecal y para ZN de 1256 copias/mg de materia fecal. Para las muestras de leche individual, 32% presentó positividad por qPCR, entretanto en tanque de leche no hubo detección. El 100% de las muestras ambientales fueron positivas por esta técnica. Como conclusión, la qPCR presenta mejor capacidad de detección, permitiendo detectar y cuantificar MAP en distintos tipos de muestra, pudiendo ser una herramienta valiosa en programas de control. Las muestras ambientales, principalmente el pool de materia fecal de la sala pre-ordeñe podría ser utilizado para monitoreos regulares para definir el estatus de un establecimiento.