La enfermedad de Chagas, causada por el protozoario Trypanosoma cruzi, continúa siendo un importante problema sanitario en América Latina, con un tratamiento limitado y poco efectivo en la etapa crónica. Si bien se ha avanzado en la comprensión del ciclo de vida del parásito y de los mecanismos que utiliza para invadir y persistir en el hospedero, muchas de las proteínas involucradas en estos procesos no han sido caracterizadas en profundidad. Una de ellas es la metaloproteasa GP63, cuya función ha sido ampliamente estudiada en Leishmania spp. donde se ha asociado a funciones clave en la invasión celular y evasión del sistema inmunológico. Este trabajo se centró en el análisis funcional del grupo 2 (G2) de GP63 en T. cruzi, con el objetivo de explorar su participación en el proceso infectivo. Para ello, se utilizó la metodología de edición genómica CRISPR-Cas9 para generar líneas mutantes deficientes en G2, empleando guías específicos dirigidos a los genes blanco y utilizando ADN donor conteniendo genes de resistencia a antibióticos. La edición se evaluó mediante PCR para comprobar el reemplazo génico y por RT-qPCR, donde el ARNm de G2 fue indetectable, lo que sugiere una sustitución exitosa de ambos alelos por los genes de resistencia. Los ensayos funcionales realizados permitieron evidenciar alteraciones fenotípicas en los mutantes, con una disminución en la capacidad de invasión celular y en la cantidad de tripomastigotas en el sobrenadante de células infectadas. Estos resultados abren nuevas preguntas sobre el rol específico de G2 en el ciclo celular y en la virulencia de T. cruzi. Asimismo, se plantea como perspectiva el abordaje de estrategias complementarias para avanzar en la caracterización funcional de esta familia, tales como el estudio de la localización subcelular y la actividad proteasa de G2, la sobreexpresión de versiones salvajes y mutantes del sitio activo, y el análisis interactómico con células hospederas. Este estudio aporta evidencia sobre el rol de la familia multigénica GP63 de T. cruzi, destacando la importancia del grupo G2, en la interacción con el hospedero y su potencial como blanco terapéutico para el control de la enfermedad de Chagas.