El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de la inclusión de pastura y distribución del tiempo de pastoreo en dietas mixtas, en el consumo de materia seca (CMS), producción y composición de leche, perfil de ácidos grasos lácteos y eficiencia del uso de los nutrientes en vacas lecheras en lactancia media. El experimento se llevó a cabo en el Instituto de Producción Animal (IPAV), Facultad de Veterinaria, Libertad, San José, Uruguay. Doce vacas Holstein multíparas con 584 ± 71 kg de peso vivo y 193 ± 83 días en lactancia, se distribuyeron en cuatro cuadrados latinos simultáneos de 3 x 3. Todos los animales pasaron por 3 tratamientos alimenticios: RTM+0h con 22 h de acceso a una ración totalmente mezclada (RTM), RTM+2x4h con 14 h de acceso a RTM más dos sesiones de 4 horas de acceso a una pastura de alfalfa luego de cada ordeñe y RTM+8h con 14h de acceso a RTM más 8 horas continuas de acceso a alfalfa luego del ordeñe vespertino. Cada período experimental consistió de 12 días de adaptación a la dieta y 7 días de mediciones. El CMS de RTM (diferencia entre ofrecido y rechazado) y alfalfa (corte del 5% del área antes y después del pastoreo) se midió individualmente durante 5 días de cada período. La producción de leche se registró también en cada período individualmente durante 5 días y se tomaron muestras durante 2 días en ambos ordeñes diarios para analizar la composición de la leche y el perfil de ácidos grasos. La eficiencia de utilización de los nutrientes para producción de leche se calculó en base a la composición química de los alimentos, los requerimientos de los animales, el consumo de nutrientes y su excreción en leche. El CMS de pastura fue de 38% del total de la MS consumida. La distribución del pastoreo en dos sesiones de 4h aumentó el CMS de pastura respecto a una sola sesión de pastoreo y mantuvo el CMS total respecto a una dieta 100% RTM. No se encontró efecto de los tratamientos sobre la producción y composición de la leche, la eficiencia de conversión del alimento, el balance de energía, la eficiencia aparente de utilización de la energía y el nitrógeno para producción de leche. La inclusión de una pastura de alfalfa de buena calidad y la distribución del pastoreo en dos sesiones en una dieta mixta para vacas lecheras mejoró el perfil nutracéutico de la grasa láctea, debido a un mayor contenido de ácidos grasos trans, con propiedades beneficiosas para la salud humana. Es posible incluir una pastura de alfalfa de buena calidad en una dieta mixta para vacas con una producción de leche de 25 L/d, sin afectar el CMS y la producción de sólidos lácteos, respecto a una dieta RTM, distribuyendo el tiempo de pastoreo en dos sesiones diarias.