La resistencia a antibióticos (RAM) es uno de las mayores amenazas a la salud pública a nivel global. En particular, los bacilos Gram negativos como Enterobacterales y Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenems se encuentran dentro del listado de microorganismos de prioridad crítica para la investigación y desarrollo de nuevos antimicrobianos. Esto se debe fundamentalmente a que se asocian a fenotipos de multidrogo resistencia, resistencia extrema y pandrogo resistencia, que limitan las opciones terapéuticas para abordar las infecciones que tratan. El objetivo de este trabajo fue caracterizar bacilos Gram negativos resistentes a carbapenems, incorporar nuevos métodos diagnósticos para su estudio, y determinar su comportamiento frente a antimicrobianos en biofilms. Se caracterizaron aislamientos de Enterobacterales y Pseudomonas spp. resistentes a carbapenems, portadores de carbapenemasas de clase B y A, y multidrogo resistentes. La evaluación in vitro de la efectividad de la combinación de ceftazidime-avibactam (CZA) con aztreonam (ATM) se estudió por sinergia de doble disco y mediante la determinación del índice de concentración inhibitoria fraccional (FICI) establecida por los valores de concentración inhibitoria mínima (CIM) a cada antibiótico solo y de CZA en presencia de 4 mg/L de ATM. Se observó efectividad de la combinación en todos los aislamientos de Enterobacterales y P. aeruginosa portadores de carbapenemasa estudiados, ya sea por susceptibilidad a uno de los agentes, test de sinergia de disco positivo y/o sinergia definida por valores de FICI <0,5. La caracterización de aislamientos de Enterobacterales y Pseudomonas spp. tanto por métodos fenotípicos, PCR y secuenciación de genomas completos, permitió identificar carbapenemasas de clase B y A circulantes en instituciones de salud nacionales, así como resistencias acompañantes y plataformas de movilización. En P. aeruginosa, se encontró blaVIM-2 como cassette en integrones de clase 1 de diferentes configuraciones, y en diferentes secuenciotipos como ST155, ST1195 y ST1565. Adicionalmente, se describieron nuevas plataformas genéticas en las que dicho gen se halló junto con blaPER-1 y qnrVC6 en unidades de transposición basadas en ISPa17 y embebidas en una estructura derivada de ISPa40, donde también se encontró por primera vez en esta especie el transposón de resistencia a amikacina TnaphA6. Adicionalmente, se caracterizó un brote hospitalario por P. aeruginosa productora de PER-1 (una β-lactamasa de espectro extendido) y perteneciente al ST309, un linaje epidémico recientemente descrito como clon de alto riesgo. blaPER-1 se halló en un transposón compuesto, en un entorno en tándem junto con ISCR1 y qnrVC6. Entre los aislamientos de Enterobacterales, se destaca la predominancia de blaNDM-1, cuya diseminación en una institución estuvo ligada a su asociación con diferentes elementos genéticos móviles. En particular, se describió un nuevo transposón compuesto, conformado por dos copias de ISKox2-like que además de portar blaNDM-1 presentaba aphA6. Esta plataforma se encontró en diferentes especies de Enterobacteriaceae y Morganellaceae y en distintos tipos de plásmidos, indicando una diseminación multicausal no clonal de blaNDM-1 en la institución durante el período estudiado. Asimismo, el tipo de plásmido más frecuente fue de tipo IncC, que podría tratarse de un plásmido exitoso, y que además presentó un integrón de clase 1 complejo con ISCR1-qnrVC6. Por otro lado, a partir de los aislamientos caracterizados, se implementaron dos metodologías de identificación rápida de carbapenemasas: PCR múltiple en tiempo real para la búsqueda simultánea de blaNDM, blaVIM, blaKPC, blaGES y blaOXA-48; y espectrometría de masas MALDI-TOF para la detección de espectros de hidrólisis de meropenem. La PCR múltiple en tiempo real identificó el 100% de los genes blaVIM, blaNDM, blaGES y blaOXA-48, mientras que blaKPC fue hallado en todos los aislamientos que lo presentaban como única carbapenemasa, pero no en los doble productores (junto con blaNDM-1). Por MALDI-TOF se identificó la producción de carbapenemasas de todos los aislamientos portadores de blaNDM, blaVIM y blaKPC, mientras que los espectros de aislamientos que presentaban blaOXA-48 mostraron hidrólisis parcial. El estudio de la capacidad de formación de biofilms y del efecto de antimicrobianos se realizó en modelo estático en placas de poliestireno, y la biomasa de los mismos se estimó por coloración con cristal violeta, solubilización y obtención del valor de la densidad óptica a 590 nm. Se observó una alta proporción de P. aeruginosa resistentes a carbapenems formadores fuertes y moderados de biofilm. Antibióticos como imipenem, meropenem, ceftazidime, amikacina, gentamicina, ciprofloxacina, fosfomicina y azitromicina no mostraron un efecto significativo sobre la biomasa de los biofilms para la mayoría de las concentraciones evaluadas. Tampoco lo hicieron otros antimicrobianos como quercetina, resveratrol y cloruro de decualinio. Sin embargo, rifampicina redujo la biomasa de los biofilms a concentraciones > 16 mg/L. La evaluación del efecto de rifampicina combinada con otros antibióticos demostró diferencias entre la actividad sobre células planctónicas y en biofilm. En particular, la combinación con amikacina demostró sinergia en sobre crecimiento planctónico, pero no sobre biofilms a las mismas concentraciones. La evaluación con mayores concentraciones de antibióticos mostró una disminución de la biomasa de los biofilms, pero con diferencias entre aislamientos. La diseminación de carbapenemasas y la emergencia de otras β-lactamasas como PER-1 constituyen un desafío epidemiológico, diagnóstico y terapéutico para nuestro medio. Esto, sumado a su asociación a linajes de alto riesgo y a determinantes de resistencia a otros grupos de antibióticos, así como la capacidad de persistir y tolerar el efecto de antibióticos en biofilms, complejiza su abordaje. Para ello, es fundamental la implementación de sistemas de diagnóstico y vigilancia que permitan mitigar el impacto que puedan representar estos microorganismos. La investigación traslacional de métodos económicos, que permitan aprovechar los recursos adquiridos por los laboratorios en los últimos años, representa una posibilidad de transferencia hacia el ámbito clínico y diagnóstico.