El objetivo de este estudio fue determinar y comparar los ácidos grasos (AG) benéficos para la salud humana presentes en la leche y en la manteca, obtenida de sistemas lecheros con diferentes niveles de inclusión de pastura en la dieta de las vacas. Se llevaron a cabo dos tratamientos de acuerdo con la proporción de pastura en la dieta: alta pastura (AP, >65%) y baja pastura (BP, <35%) (n=6). Las muestras de leche fueron recolectadas, con frecuencia quincenal, a partir de leche de tanque de establecimientos lecheros ubicados en la cuenca lechera litoral norte de Uruguay. La manteca se elaboró utilizando leche de dos tambos seleccionados con sistemas de manejo y alimentación contrastantes: sistema mixto (basado en pastoreo con suplementación) (MIX), y sistema confinado con dieta total mezclada (100% DTM; C-DTM). La grasa de la leche y manteca se extrajo utilizando el método de Röse-Gottlieb, mientras que la grasa de los alimentos se extrajo con la técnica de Hara & Radin. La composición de AG en leche, manteca y alimentos se determinó mediante cromatografía de gases. La leche de AP mostró una mayor proporción de AG considerados beneficiosos para la salud humana, tales como el ácido trans-vaccénico (TVA) (p=0.012), ácido linoleico conjugado (CLA) (p=0.014), 18:3 n-3 (p=0.033), total de AG de cadena ramificada (AGCR) (p=0.006), y AG de cadena impar ramificados (AGCIR) como 15:0 iso y anteiso (p=0.029; p=0.008, respectivamente) y 17:0 iso (p=0.005), en comparación con la leche de BP. La manteca del establecimiento MIX mostró mayores porcentajes de 15:0 (p=0.025), 17:0 (p=0.030), 15:0 anteiso (p=0.012), AG monoinsaturados totales (AGMI) (p=0.037), TVA (p=0.024) y CLA (p=0.042) que el C-DTM. Aunque no se encontraron diferencias significativas en la relación n-6/n-3, la leche de AP presentó una relación de 2/1, mientras que la leche BP mostró una relación de 5/1, valores por encima de los niveles recomendados. En conclusión, una mayor inclusión de pastura en los sistemas lecheros no solo mejora el perfil de AG de la leche, sino que también da como resultado un producto final (manteca) con características nutricionales más favorables para la salud humana.