Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos

Elenter Litwin, Nicole

Resumen:

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) y los genes asociados a CRISPR (Cas) son elementos esenciales del sistema inmune adaptativo de algunas bacterias y arqueas, al intervenir en la eliminación de material exógeno invasor. El sistema tipo II de CRISPR es la herramienta más utilizada para la edición génica, permitiendo la obtención de diversos modelos animales. El ratón de laboratorio (Mus musculus) es el animal de investigación por excelencia. La generación de modelos murinos genéticamente modificados mediante la técnica de CRISPR implicaba necesariamente la microinyección de material exógeno en los ovocitos. Esta técnica presenta ciertas desventajas: personal altamente calificado, un trabajo laborioso y lento, causando la muerte de la mitad de los embriones. Como alternativa a la microinyección surge la electroporación. Esta implica la generación de poros en la membrana de los cigotos mediante la aplicación de pulsos cortos. A diferencia de la microinyección, la electroporación se caracteriza por su simpleza, rapidez y costos de producción bajos. Durante este trabajo se efectuó la puesta a punto de un protocolo para la generación de embriones genéticamente modificados mediante la electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos. En primer lugar, se optimizó el tiempo de tratamiento con ácido tirodes (AT) de los cigotos. Con una solución de AT, se degradó un porcentaje de la zona pelúcida lo suficientemente alto para permitir el ingreso de las RNPs, sin ir en desmedro del desarrollo del embrión. Además, se determinó el protocolo óptimo para la generación de embriones knockout (KO) del gen Clec4F. Las condiciones óptimas seleccionadas fueron electroporaciones de 10 pulsos de 30V, con una duración de 3ms y un intervalo entre pulsos de 100ms, y concentraciones de RNPs de 250ng/μl de proteína Cas9 y 300ng/μl 5 de sgRNA. Estas condiciones fueron determinadas con embriones de la cepa híbrida de ratones B6D2F1/J, obteniéndose un desarrollo a blastocisto de 16,4% y una de eficiencia de mutación de 70,0%. Se probó que este protocolo es válido para generar embriones KO para el mismo gen en la cepa consanguínea de ratones C57BL/6J. Se obtuvo para esta cepa un porcentaje de desarrollo a blastocisto de 6,5% y una eficiencia de mutación de 85,7%. Por último, se intentó insertar un sitio loxP en embriones de la cepa híbrida. Si bien no se obtuvo una alta eficiencia de knockin (KI), se lograron resultados de desarrollo y eficiencia de mutación de KO de 41,1% y 100,0% respectivamente.


Detalles Bibliográficos
2019
ANIMALES
EMBRIÓN
LABORATORIOS
PROYECTOS-BI
Español
Universidad ORT Uruguay
RAD
http://hdl.handle.net/20.500.11968/4081
Acceso abierto
_version_ 1807261359578021888
author Elenter Litwin, Nicole
author_facet Elenter Litwin, Nicole
author_role author
bitstream.checksum.fl_str_mv b668f0528224a36a5c6486933238f578
9495e6155d537a74d67d04aa1e0cbcda
bitstream.checksumAlgorithm.fl_str_mv MD5
MD5
bitstream.url.fl_str_mv https://rad.ort.edu.uy/bitstreams/68c6df87-80d9-4ff7-9314-a4745d460ff3/download
https://rad.ort.edu.uy/bitstreams/7714fadf-14db-40d9-b2b5-3fe1de65d50b/download
collection RAD
dc.contributor.advisor.none.fl_str_mv Crispo, Martina
Mulet Navarro, Ana Paula
dc.contributor.tribunal.es.fl_str_mv Abreu Olano, Cecilia
Badano Caballero, José Luis
dc.creator.none.fl_str_mv Elenter Litwin, Nicole
dc.date.accessioned.none.fl_str_mv 2019-11-29T08:01:13Z
dc.date.available.none.fl_str_mv 2019-11-29T08:01:13Z
dc.date.issued.es.fl_str_mv 2019
dc.description.abstract.none.fl_txt_mv CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) y los genes asociados a CRISPR (Cas) son elementos esenciales del sistema inmune adaptativo de algunas bacterias y arqueas, al intervenir en la eliminación de material exógeno invasor. El sistema tipo II de CRISPR es la herramienta más utilizada para la edición génica, permitiendo la obtención de diversos modelos animales. El ratón de laboratorio (Mus musculus) es el animal de investigación por excelencia. La generación de modelos murinos genéticamente modificados mediante la técnica de CRISPR implicaba necesariamente la microinyección de material exógeno en los ovocitos. Esta técnica presenta ciertas desventajas: personal altamente calificado, un trabajo laborioso y lento, causando la muerte de la mitad de los embriones. Como alternativa a la microinyección surge la electroporación. Esta implica la generación de poros en la membrana de los cigotos mediante la aplicación de pulsos cortos. A diferencia de la microinyección, la electroporación se caracteriza por su simpleza, rapidez y costos de producción bajos. Durante este trabajo se efectuó la puesta a punto de un protocolo para la generación de embriones genéticamente modificados mediante la electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos. En primer lugar, se optimizó el tiempo de tratamiento con ácido tirodes (AT) de los cigotos. Con una solución de AT, se degradó un porcentaje de la zona pelúcida lo suficientemente alto para permitir el ingreso de las RNPs, sin ir en desmedro del desarrollo del embrión. Además, se determinó el protocolo óptimo para la generación de embriones knockout (KO) del gen Clec4F. Las condiciones óptimas seleccionadas fueron electroporaciones de 10 pulsos de 30V, con una duración de 3ms y un intervalo entre pulsos de 100ms, y concentraciones de RNPs de 250ng/μl de proteína Cas9 y 300ng/μl 5 de sgRNA. Estas condiciones fueron determinadas con embriones de la cepa híbrida de ratones B6D2F1/J, obteniéndose un desarrollo a blastocisto de 16,4% y una de eficiencia de mutación de 70,0%. Se probó que este protocolo es válido para generar embriones KO para el mismo gen en la cepa consanguínea de ratones C57BL/6J. Se obtuvo para esta cepa un porcentaje de desarrollo a blastocisto de 6,5% y una eficiencia de mutación de 85,7%. Por último, se intentó insertar un sitio loxP en embriones de la cepa híbrida. Si bien no se obtuvo una alta eficiencia de knockin (KI), se lograron resultados de desarrollo y eficiencia de mutación de KO de 41,1% y 100,0% respectivamente.
dc.description.es.fl_txt_mv Incluye bibliografía.
dc.format.extent.es.fl_str_mv 103 p. il., diagrs., fot.
dc.identifier.citation.es.fl_str_mv Elenter Litwin, N. (2019). Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos (Trabajo final de carrera). Universidad ORT Uruguay, Facultad de Ingeniería. Recuperado de https://rad.ort.edu.uy/handle/20.500.11968/4081
dc.identifier.uri.none.fl_str_mv http://hdl.handle.net/20.500.11968/4081
http://hdl.handle.net/20.500.11968/4081
dc.language.iso.none.fl_str_mv Español.
spa
dc.publisher.es.fl_str_mv Universidad ORT Uruguay
dc.relation.other.es.fl_str_mv https://bibliotecas.ort.edu.uy/bibid/89750
dc.rights.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
dc.source.none.fl_str_mv reponame:RAD
instname:Universidad ORT Uruguay
instacron:Universidad ORT
dc.subject.es.fl_str_mv ANIMALES
EMBRIÓN
LABORATORIOS
PROYECTOS-BI
dc.title.none.fl_str_mv Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos
dc.type.es.fl_str_mv Trabajo final de carrera
dc.type.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/bachelorThesis
dc.type.version.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
description Incluye bibliografía.
eu_rights_str_mv openAccess
format bachelorThesis
id RAD_50cf7cf980195c8605d7582a1c8216d3
identifier_str_mv Elenter Litwin, N. (2019). Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos (Trabajo final de carrera). Universidad ORT Uruguay, Facultad de Ingeniería. Recuperado de https://rad.ort.edu.uy/handle/20.500.11968/4081
instacron_str Universidad ORT
institution Universidad ORT
instname_str Universidad ORT Uruguay
language spa
language_invalid_str_mv Español.
network_acronym_str RAD
network_name_str RAD
oai_identifier_str oai:rad.ort.edu.uy:20.500.11968/4081
publishDate 2019
reponame_str RAD
repository.mail.fl_str_mv rodriguez_v@ort.edu.uy
repository.name.fl_str_mv RAD - Universidad ORT Uruguay
repository_id_str 3927
spelling Crispo, MartinaMulet Navarro, Ana PaulaAbreu Olano, CeciliaBadano Caballero, José LuisElenter Litwin, Nicole2019-11-29T08:01:13Z2019-11-29T08:01:13Z2019Incluye bibliografía.CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) y los genes asociados a CRISPR (Cas) son elementos esenciales del sistema inmune adaptativo de algunas bacterias y arqueas, al intervenir en la eliminación de material exógeno invasor. El sistema tipo II de CRISPR es la herramienta más utilizada para la edición génica, permitiendo la obtención de diversos modelos animales. El ratón de laboratorio (Mus musculus) es el animal de investigación por excelencia. La generación de modelos murinos genéticamente modificados mediante la técnica de CRISPR implicaba necesariamente la microinyección de material exógeno en los ovocitos. Esta técnica presenta ciertas desventajas: personal altamente calificado, un trabajo laborioso y lento, causando la muerte de la mitad de los embriones. Como alternativa a la microinyección surge la electroporación. Esta implica la generación de poros en la membrana de los cigotos mediante la aplicación de pulsos cortos. A diferencia de la microinyección, la electroporación se caracteriza por su simpleza, rapidez y costos de producción bajos. Durante este trabajo se efectuó la puesta a punto de un protocolo para la generación de embriones genéticamente modificados mediante la electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos. En primer lugar, se optimizó el tiempo de tratamiento con ácido tirodes (AT) de los cigotos. Con una solución de AT, se degradó un porcentaje de la zona pelúcida lo suficientemente alto para permitir el ingreso de las RNPs, sin ir en desmedro del desarrollo del embrión. Además, se determinó el protocolo óptimo para la generación de embriones knockout (KO) del gen Clec4F. Las condiciones óptimas seleccionadas fueron electroporaciones de 10 pulsos de 30V, con una duración de 3ms y un intervalo entre pulsos de 100ms, y concentraciones de RNPs de 250ng/μl de proteína Cas9 y 300ng/μl 5 de sgRNA. Estas condiciones fueron determinadas con embriones de la cepa híbrida de ratones B6D2F1/J, obteniéndose un desarrollo a blastocisto de 16,4% y una de eficiencia de mutación de 70,0%. Se probó que este protocolo es válido para generar embriones KO para el mismo gen en la cepa consanguínea de ratones C57BL/6J. Se obtuvo para esta cepa un porcentaje de desarrollo a blastocisto de 6,5% y una eficiencia de mutación de 85,7%. Por último, se intentó insertar un sitio loxP en embriones de la cepa híbrida. Si bien no se obtuvo una alta eficiencia de knockin (KI), se lograron resultados de desarrollo y eficiencia de mutación de KO de 41,1% y 100,0% respectivamente.103 p. il., diagrs., fot.Elenter Litwin, N. (2019). Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos (Trabajo final de carrera). Universidad ORT Uruguay, Facultad de Ingeniería. Recuperado de https://rad.ort.edu.uy/handle/20.500.11968/4081http://hdl.handle.net/20.500.11968/4081http://hdl.handle.net/20.500.11968/4081Español.spaUniversidad ORT Uruguayhttps://bibliotecas.ort.edu.uy/bibid/89750ANIMALESEMBRIÓNLABORATORIOSPROYECTOS-BIElectroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinosTrabajo final de carrerainfo:eu-repo/semantics/bachelorThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionreponame:RADinstname:Universidad ORT Uruguayinstacron:Universidad ORTinfo:eu-repo/semantics/openAccessFI - Ingeniería en Biotecnología - BIFacultad de IngenieríaCarrera UniversitariaIngeniera en BiotecnologíaTrabajo final de carreraTrabajo final de carrera (Carrera Universitaria). Universidad ORT Uruguay, Facultad de IngenieríaTHUMBNAILMaterial completo.pdf.jpgMaterial completo.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg2837https://rad.ort.edu.uy/bitstreams/68c6df87-80d9-4ff7-9314-a4745d460ff3/downloadb668f0528224a36a5c6486933238f578MD53ORIGINALMaterial completo.pdfMaterial completo.pdfdescriptionapplication/pdf1813215https://rad.ort.edu.uy/bitstreams/7714fadf-14db-40d9-b2b5-3fe1de65d50b/download9495e6155d537a74d67d04aa1e0cbcdaMD5120.500.11968/40812024-07-22 16:10:07.339oai:rad.ort.edu.uy:20.500.11968/4081https://rad.ort.edu.uyUniversidadhttps://www.ort.edu.uy/https://rad.ort.edu.uy/server/oai/requestrodriguez_v@ort.edu.uyUruguayopendoar:39272024-07-22T16:10:07RAD - Universidad ORT Uruguayfalse
spellingShingle Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos
Elenter Litwin, Nicole
ANIMALES
EMBRIÓN
LABORATORIOS
PROYECTOS-BI
status_str publishedVersion
title Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos
title_full Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos
title_fullStr Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos
title_full_unstemmed Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos
title_short Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos
title_sort Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos
topic ANIMALES
EMBRIÓN
LABORATORIOS
PROYECTOS-BI
url http://hdl.handle.net/20.500.11968/4081