La biodiversidad vegetal de Uruguay ha sido históricamente subrepresentada en iniciativas de secuenciación de códigos de barras de ADN, a pesar de la importancia de su flora nativa para los ecosistemas regionales y su valor cultural. En este estudio, se presenta el primer esfuerzo coordinado para generar secuencias de referencia de ADN de plantas vasculares uruguayas, mediante la aplicación de marcadores universales de código de barras. Se seleccionaron 50 especies de interés ecológico, agrícola y medicinal, sin representación previa en BOLD, y se procesaron 51 muestras provenientes de colecciones de herbario y material fresco. Se amplificaron y secuenciaron cuatro regiones moleculares ampliamente utilizadas en plantas: rbcL, trnH-psbA, trnL (UAA) e ITS2. Se obtuvieron un total de 171 secuencias de alta calidad. Los marcadores trnL (UAA) y rbcL mostraron una alta tasa de éxito en la amplificación y secuenciación, confirmando su utilidad en la flora regional. En contraste, ITS2 presentó una menor eficiencia, posiblemente asociada a las características taxonómicas de algunos grupos incluidos. Los resultados fueron integrados a la base de datos BOLD, constituyendo el primer conjunto de códigos de barras de ADN para plantas vasculares de Uruguay depositado en un repositorio internacional. Este trabajo representa un avance significativo en el fortalecimiento de capacidades nacionales en taxonomía molecular y conservación de la biodiversidad, y sienta las bases para futuras iniciativas integradas en el marco de la Iniciativa Barcode of Life Uruguay (BoL-UY). Asimismo, contribuye a subsanar vacíos de información en bases globales y proporciona una herramienta fundamental para la identificación rápida de especies y el monitoreo de comunidades vegetales en paisajes altamente transformados.