Durante el desarrollo tumoral inicial, las células deben adaptarse a un microambiente hipóxico, afrontando adaptaciones al estrés causado por la hipoxia, que además de la falta de oxígeno conlleva asimismo el aumento de la acidificación y del estrés oxidativo, con profundas consecuencias para la fisiología celular y la evolución futura del tumor. Por lo tanto, la interacción entre la hipoxia y el estrés oxidativo es un aspecto importante para comprender los efectos del microambiente hipóxico en las células. En trabajos previos, a partir de queratinocitos humanos de la línea celular no tumoral HaCaT, se han generado células que expresan establemente los oncogenes E5, E6 Y E7 del virus HPV-18 (HaCaT E5/E6/E7-18), muy asociados a cánceres de alta prevalencia, como el cáncer de cuello de útero y el carcinoma oral. Las células HaCaT E5/E6/E7-18 así obtenidas representan un modelo celular muy útil para estudiar etapas tempranas del desarrollo tumoral. Por otra parte, se ha utilizado una variante del método de hipoxia inducida por cubreobjetos, desarrollada previamente, que permite recapitular los gradientes de hipoxia in vitro del microambiente tumoral temprano. De esta forma, se pudo estudiar el proceso de acidificación de las células HaCaT E5/E6/E7-18 en un microambiente hipóxico y visualizar, simultáneamente, los niveles intracelulares de hipoxia y estrés oxidativo de las mismas. Se observó una alta acumulación de CO2 en condiciones hipóxicas, que es el principal contribuyente a la acidificación en el modelo utilizado. Además, se observaron mayores niveles de especies reactivas del oxígeno en células moderadamente hipóxicas cercanas a la fuente de oxígeno, donde se conservó el potencial de la membrana mitocondrial. Por el contrario, las células a grandes distancias de la fuente de oxígeno mostraron niveles más altos de hipoxia, menor nivel de especies reactivas del oxígeno y un potencial de membrana mitocondrial reducido. Estos resultados contribuyen a caracterizar la interacción entre los niveles reducidos de oxígeno, la acidificación y el estrés oxidativo en un entorno in vitro simple, que se puede utilizar para modelar las respuestas celulares a un ambiente alterado, como el microambiente tumoral temprano.