Ilex paraguariensis St. Hil. es una planta subtropical perteneciente a la familia Aquifoliaceae, posee follaje siempre verde, porte arborescente y es longeva. Su distribución natural abarca los territorios de Brasil, Argentina, Paraguay y Uruguay. Es una especie de gran interés social, cultural y comercial porque con sus hojas se elabora la yerba, principal ingrediente del “Mate” o “Tereré”. En Uruguay las poblaciones naturales de I. paraguariensis representan el límite sur de la distribución de la especie, localizándose en áreas de refugio o “Hot Spots” ubicadas en el norte y este del país. Se tiene escasa información sobre el número, localización y tamaño de las poblaciones uruguayas, así como de su diversidad genética, pero se cree que pueden aportar variantes de interés para el mejoramiento y conservación de la especie. Es el propósito de este trabajo relevar y georeferenciar las poblaciones de I. paraguariensis en el territorio uruguayo, evaluar la estructuración geográfica de la variabilidad haplotípica en dicho territorio y analizar la diferenciación entre las posibles poblaciones bajo la hípotesis de que es alta comparada con la encontrada en el resto de su distribución natural. Para ello, se procedió a obtener el ADN de 273 individuos georeferenciados distribuidos a lo largo de 14 sitios de colecta en bosques relictuales de Uruguay, agregando 4 muestras de Argentina, Brasil y Paraguay. Se seleccionó marcadores informativos para las poblaciones colectadas a partir de un conjunto de 30 microsatélites cloroplásticos y se correlacionó la información obtenida con la ubicación geográfica. Las poblaciones uruguayas aparecen altamente estructuradas y diferenciadas de las muestras obtenidas de poblaciones de Paraguay, Argentina y Brasil. Este trabajo ha obtenido información nueva que valoriza el germoplasma existente en las poblaciones de yerba mate nativas de Uruguay. Los resultados obtenidos permiten inferir diferenciación genética significativa y ausencia de flujo de semillas entre poblaciones con importantes implicancias para la conservación y exploración del germoplasma y suman evidencia acerca del panorama que se viene conformando sobre la biogeografía de la región en la que se encuentra Uruguay.