Las enzimas catalizan un importante número de reacciones, a menudo con regio o estero selectividad muy precisa, hacienda posible una variedad de procesos catalíticos que no serían posibles o son impracticables por síntesis convencional. El uso aplicado de enzimas en biocatálisis se afianza año a año con la aparición de nuevos y mejores biocatalizadores que facilitan la producción de moléculas de interés biotecnológico. Cada vez son más comunes los procesos en los que se combinan varias enzimas actuando secuencialmente. El uso de sistemas enzimáticos acoplados puede mejorar la cinética de las reacciones, disminuir la pérdida de intermediarios o evitar la inactivación o inhibición de una de las enzimas del sistema por eliminación rápida de algún intermediario inactivante. Sin embargo, la naturaleza soluble de las enzimas presenta restricciones específicas para su uso aplicado: pobre estabilidad, dificultad de separación, contaminación de productos y reuso limitado. La inmovilización de enzimas es usada comúnmente para mejorar estas limitaciones ya que muchas veces provee efectos estabilizantes, facilita su separación del medio de reacción y su reuso. En este trabajo de Maestría hemos abordado el estudio de sistemas enzimáticos que acoplados funcionan para producir moléculas de interés industrial. Nuestros estudios incluyeron la inmovilización de todas las enzimas de las vías sintéticas seleccionadas, caracterización y utilización in vitro. Muchos de los biocatalizadores utilizados debieron ser expresados de manera recombinante y purificados parcialmente previamente a su utilización. Las estrategias de inmovilización utilizadas incluyeron interacción covalente y atrapamiento físico. Además de utilizar agarosa como soporte de inmovilización se planteó el uso de un nuevo soporte para la unión de enzimas: las nanopartículas de sílica biomimética. Para mejorar las propiedades de este soporte para la unión de proteínas hemos propuesto una estrategia de síntesis novedosa que incluye moldes proteicos y genera nanopartículas más pequeñas y más homogéneas en tamaño. Para todas las enzimas con las que se trabajó se lograron preparar inmovilizados activos, en algunos casos muy estables, alcanzándose factores de estabilización sin precedentes en la literatura. Nuestros estudios permitieron el acoplamiento de 5 enzimas que en una secuencia no natural funcionaron en la producción enantioselectiva del L-ácido láctico a partir de mezclas racémicas de Alanina. Además, la co-inmovilización en un mismo soporte de dos enzimas que en la naturaleza funcionan secuencialmente en la vía de síntesis del antibiótico butirosina B, permitió la producción del antibiótico in vitro a partir de un Tesis de Maestría en Química Lic. Erienne Jackson sustrato alternativo que debimos sintetizar químicamente. Asimismo, hemos sentado las bases para la inmovilización de uno de los sistemas enzimáticos más complejos de la naturaleza, las poliquétido sintasas demostrando mediante el seguimiento de actividades parciales su estabilización frente al complejo no inmovilizado. En todos estos sistemas hemos demostrado que un diseño adecuado de los procesos de inmovilización facilita el acoplamiento de múltiples enzimas trabajando en tándem para la síntesis in vitro de moléculas de interés biotecnológico.