El epitelio intestinal desempeña funciones cruciales, como la absorción de nutrientes, la interacción con la microbiota y la respuesta inmune. Alteraciones en la homeostasis de este tejido pueden llevar al desarrollo de varios desórdenes como procesos inflamatorios, infecciosos o cáncer. Contar con modelos apropiados que permitan estudiar los mecanismos involucrados en las enfermedades intestinales es importante para el avance en el desarrollo de nuevas terapias. Tradicionalmente, los modelos de cultivo celular emplean células adherentes creciendo en monocapas. Estos constituyen sistemas de estudio simples y económicos. Sin embargo, al ser sistemas en dos dimensiones compuestos por un único tipo celular, no reflejan la complejidad de las interacciones celulares que ocurren en un tejido in vivo, limitando su poder predictivo. En este contexto, los cultivos en tres dimensiones (3D) se presentan como una interesante alternativa in vitro para el estudio de mecanismos fisiopatológicos y para el screening de compuestos bioactivos. Los organoides intestinales, también conocidos como “mini-intestinos”, constituyen un tipo de cultivos 3D, constituidos por estructuras multicelulares que se auto-ensamblan recreando la morfología y fisiología del epitelio intestinal y que, al contener células madre, tienen un poder replicativo ilimitado. Bajo la premisa de que la integración del cultivo de organoides intestinales podría constituir una innovadora tecnología de cultivos 3D a nivel nacional, y considerando su complejidad superior en comparación con los cultivos convencionales, el objetivo de este trabajo fue implementar del cultivo de organoides intestinales murinos utilizando células madre adultas. Este enfoque se orientó hacia la exploración de su aplicabilidad en el análisis de las interacciones hospedero-microbiota y hospedero-patógeno, así como en la creación de nuevos sistemas reporteros del epitelio intestinal mediante el empleo de técnicas de edición génica. Se generaron bancos de organoides de las distintas partes del intestino murino utilizando ratones de cepas salvajes y reporteros para la activación de NF-κB (Balb/C-NF-κB-RE-luc). Se evaluó la forma, tamaño y capacidad proliferativa de los organoides mediante la técnica de capacidad formadora de colonias evaluada por microscopía óptica y se determinaron los tipos celulares presentes en estos organoides mediante qPCR. Los organoides reporteros se emplearon para evaluar el potencial inmunomodulador de distintas bacterias y productos derivados de la microbiota intestinal en estos organoides utilizando medios condicionados de cepas probióticas y de microbiota humana. Se lograron establecer las condiciones para infectar organoides murinos con Trypanosoma cruzi, modelando la fase crónica de la enfermedad y la infección oral. Por último, se evaluó la interacción de los organoides intestinales con células del estroma en modelo de co-cultivo en transwell con fibroblastos, destacando que la presencia de las células estromales favorece la diferenciación de la monocapa de organoides. En suma, en este trabajo se implementaron los organoides intestinales murinos como tecnología de cultivo 3D, demostrando su utilidad en diversos estudios que van desde la interacción microbiota hasta la respuesta a patógenos, contribuyendo al avance de nuevos modelos in vitro relevantes para la etapa pre clínica.