Actividad proteolítica del látex de plantas indígenas uruguayas: obtención de péptidos antimicrobianos y/o antioxidantes
Supervisor(es): Cantera, Ana María - Villadóniga, Carolina
Resumen:
Las proteasas, además de sus importantes roles fisiológicos, son de gran interés industrial. El látex de diversas plantas es una fuente importante de estas enzimas, relacionadas con la defensa contra patógenos. Una aplicación biotecnológica relevante es la generación de péptidos bioactivos por hidrólisis in vitro de proteínas. Se obtuvieron extractos proteolíticos a partir de látex de especies nativas de la región, en particular de Ficus luschnathiana (Miq.) Miq., un árbol de la familia Moraceae y de Araujia sericifera var. hortorum (E. Fourn.), una enredadera perteneciente a la familia Apocinaceae, subfamilia Asclepiadaceae. Se realizó la caracterización parcial de los extractos crudos, denominados EC(Ficus) y EC(Araujia). En este trabajo se describió y caracterizó por primera vez la actividad proteolítica del EC(Ficus). En cuanto al EC(Araujia), sus peptidasas han sido reportadas previamente, por lo que este trabajo se centró en la caracterización de aquellos aspectos del extracto sobre los que aún faltaba información. El EC(Ficus) mostró actividad proteolítica del tipo serínica. Los estudios del efecto del pH y la temperatura en su actividad dieron como resultado máximos a pH 7.5 - 8.0 y 75 ºC, respectivamente. La actividad mostró alta estabilidad cuando el extracto fue incubado a diversas condiciones de pH y temperatura. Se mantuvo el 96 % de actividad después de un almacenamiento de 5 meses a 7 ºC y pH 7.5. En cambio, el EC(Araujia) tuvo una vida media de 40 días en estas condiciones. Respecto a temperaturas compatibles con aplicaciones industriales el EC(Ficus) tuvo una vida media de 14 h a 60 ºC y pH 7.5, mientras que para el EC(Araujia), a 50 ºC y pH7.5 la vida media fue de 140 min. El EC(Ficus) fue más estable a pH 6.5 y el EC(Araujia) en el rango de pH 6.0 a 9.0. En ambos casos un medio fuertemente alcalino (pH 9.9) fue el menos favorable.Se emplearon diferentes técnicas de análisis molecular como cromatografías de exclusión molecular, intercambios iónicos, espectrometrías de masas y estudios electroforéticos para estudiar la composición proteica del EC(Ficus). El extracto mostró una composición altamente compleja, conformada por especies polipeptídicas de diferentes tamaños y puntos isoeléctricos, con tendencia a formar agregados dependiendo del pH del medio. Las peptidasas del extracto mantuvieron su actividad en presencia de SDS y agentes reductores. Los extractos crudos fueron capaces de hidrolizar proteínas de lactosueros en condiciones controladas de pH y temperatura. Las fracciones obtenidas se evaluaron en cuanto a su capacidad antioxidante y/o antimicrobiana frente a cepas de E. coli y S. aureus. Con el EC(Ficus) se obtuvieron fracciones de concentración peptídica 0.96 Umol mL-1 , que lograron inhibir el 94 ± 4 % del crecimiento de S. aureus. El uso del EC(Araujia) permitió obtener fracciones con capacidad antioxidante de 112,4 ± 4,2 equivalentes Trolox (μM). Estudios espectrométricos sugieren que los péptidos derivados de la β lactoglobulina podrían ser responsables de esta actividad. Los resultados logrados, aprovechando recursos naturales y utilizando procesos controlados y reproducibles desarrollados en condiciones de reacción económicamente sostenibles a escala industrial, hacen del presente trabajo una contribución prometedora para potenciales aplicaciones tecnológicas.
2023 | |
Enzimas proteolítica Látex Lactosuero Péptidos bioactivos |
|
Español | |
Universidad de la República | |
COLIBRI | |
https://hdl.handle.net/20.500.12008/41890 | |
Acceso abierto | |
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dc.description.tableofcontents.es.fl_txt_mv | Agradecimientos -- Resumen en español -- Resumen en inglés -- Índice -- Lista de abreviaturas y siglas -- 1- Introducción -- 1.1- Enzimas proteolíticas -- 1.1.1- Definición -- 1.1.2- Clasificación -- 1.1.3- Funciones fisiológicas -- 1.1.4- Enzimas proteolíticas en látex -- 1.2- Especies laticíferas nativas -- 1.2.1- Ficus luschnathiana -- 1.2.2- Araujia sericífera -- 1.2.3- Sapium glandulosum --1.3- Aplicaciones de las enzimas proteolíticas -- 1.4- Péptidos bioactivos -- 1.4.1- Péptidos antimicrobianos -- 1.4.2- Péptidos antioxidantes -- 1.5- Proteínas de origen lácteo como fuentes de péptidos bioactivos -- 1.5.1- Lactosuero -- 2- Objetivos -- 2.1- Objetivos generales -- 2.2- Objetivos específicos -- 3- Materiales y métodos -- 3.1- Materiales -- 3.2- Métodos -- 3.2.1-- Preparación del lactosuero de caseinería -- 3.2.2- Obtención de los extractos crudos -- 3.2.3- Determinación de concentraciones de proteínas y péptidos -- 3.2.4- Determinación de la actividad proteolítica -- 3.2.5- Determinación de la capacidad de coagulación de la leche -- 3.2.6- Parado térmico y efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la actividad proteolítica -- 3.2.7- Efecto del pH sobre la estabilidad de la actividad proteolítica -- 3.2.8- Efecto del pH y la temperatura en la actividad proteolítica de los extractos -- 3.2.9- Efecto de inhibidores en la actividad proteolítica -- 3.2.10- Cromatografías de exclusión molecular -- 3.2.11- Intercambio iónico del EC(Ficus) -- 3.2.12- Determinación de puntos isoeléctricos -- 3.2.13- Hidrólisis de las proteínas del lactosuero -- 3.2.14- Electroforesis en geles de poliacrilamida -- 3.2.15- Zimogramas -- 3.2.16- Fraccionamiento de los productos de hidrólisis -- 3.2.17- Evaluación de la actividad antimicrobiana -- 3.2.18- Cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa (RP-HPLC). 48 3.2.19- Evaluación de la actividad antioxidante -- 3.2.20- Espectrometría de masas -- 3.2.21- Análisis estadístico -- 4- Resultados y discusión -- 4.1- Caracterización de la actividad proteolítica de los extractos -- 4.1.1- Actividad proteolítica de los extractos crudos, efecto de inhibidores y agentes reductores -- 4.1.2- Determinación de la capacidad de coagulación de la leche -- 4.1.3- Efecto del pH y la temperatura en la actividad proteolítica de los extractos -- 4.1.4- Efecto del pH y la temperatura sobre la estabilidad de la actividad proteolítica de los extractos -- 4.2- Características moleculares del extracto crudo de Ficus luschnathiana -- 4.2.1- Evaluación de la ocurrencia de autolisis de las peptidasas del EC(Ficus) -- 4.2.2- Fraccionamiento del EC(Ficus) por cromatografía de exclusión molecular -- 4.2.3- Evaluación de la formación de agregados moleculares dependientes del pH del medio -- 4.2.4- Fraccionamiento del EC(Ficus) por intercambio iónico -- 4.3- Hidrólisis de sueros lácteos -- 4.4- Obtención de péptidos antimicrobianos -- 4.5- Obtención de péptidos antioxidantes -- 4.6- Análisis de las secuencias de los péptidos antioxidantes -- 5- Discusión general -- 6- Conclusiones -- 7- Anexos --I- Características de la extracción y ejemplos de valores de actividad de los extractos crudos -- II- Ecuaciones de las curvas de calibración -- III- Códigos de denominación de aminoácidos -- IV- Portadas de los trabajos publicados -- 8- Referencias |
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Se realizó la caracterización parcial de los extractos crudos, denominados EC(Ficus) y EC(Araujia). En este trabajo se describió y caracterizó por primera vez la actividad proteolítica del EC(Ficus). En cuanto al EC(Araujia), sus peptidasas han sido reportadas previamente, por lo que este trabajo se centró en la caracterización de aquellos aspectos del extracto sobre los que aún faltaba información. El EC(Ficus) mostró actividad proteolítica del tipo serínica. Los estudios del efecto del pH y la temperatura en su actividad dieron como resultado máximos a pH 7.5 - 8.0 y 75 ºC, respectivamente. La actividad mostró alta estabilidad cuando el extracto fue incubado a diversas condiciones de pH y temperatura. Se mantuvo el 96 % de actividad después de un almacenamiento de 5 meses a 7 ºC y pH 7.5. En cambio, el EC(Araujia) tuvo una vida media de 40 días en estas condiciones. Respecto a temperaturas compatibles con aplicaciones industriales el EC(Ficus) tuvo una vida media de 14 h a 60 ºC y pH 7.5, mientras que para el EC(Araujia), a 50 ºC y pH7.5 la vida media fue de 140 min. El EC(Ficus) fue más estable a pH 6.5 y el EC(Araujia) en el rango de pH 6.0 a 9.0. En ambos casos un medio fuertemente alcalino (pH 9.9) fue el menos favorable.Se emplearon diferentes técnicas de análisis molecular como cromatografías de exclusión molecular, intercambios iónicos, espectrometrías de masas y estudios electroforéticos para estudiar la composición proteica del EC(Ficus). El extracto mostró una composición altamente compleja, conformada por especies polipeptídicas de diferentes tamaños y puntos isoeléctricos, con tendencia a formar agregados dependiendo del pH del medio. Las peptidasas del extracto mantuvieron su actividad en presencia de SDS y agentes reductores. 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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 25790 bytes, checksum: 489f03e71d39068f329bdec8798bce58 (MD5) TD_Barros.pdf: 4026238 bytes, checksum: 17b3867645853e37df30d6fbada551ca (MD5) Previous issue date: 2023Agradecimientos -- Resumen en español -- Resumen en inglés -- Índice -- Lista de abreviaturas y siglas -- 1- Introducción -- 1.1- Enzimas proteolíticas -- 1.1.1- Definición -- 1.1.2- Clasificación -- 1.1.3- Funciones fisiológicas -- 1.1.4- Enzimas proteolíticas en látex -- 1.2- Especies laticíferas nativas -- 1.2.1- Ficus luschnathiana -- 1.2.2- Araujia sericífera -- 1.2.3- Sapium glandulosum --1.3- Aplicaciones de las enzimas proteolíticas -- 1.4- Péptidos bioactivos -- 1.4.1- Péptidos antimicrobianos -- 1.4.2- Péptidos antioxidantes -- 1.5- Proteínas de origen lácteo como fuentes de péptidos bioactivos -- 1.5.1- Lactosuero -- 2- Objetivos -- 2.1- Objetivos generales -- 2.2- Objetivos específicos -- 3- Materiales y métodos -- 3.1- Materiales -- 3.2- Métodos -- 3.2.1-- Preparación del lactosuero de caseinería -- 3.2.2- Obtención de los extractos crudos -- 3.2.3- Determinación de concentraciones de proteínas y péptidos -- 3.2.4- Determinación de la actividad proteolítica -- 3.2.5- Determinación de la capacidad de coagulación de la leche -- 3.2.6- Parado térmico y efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la actividad proteolítica -- 3.2.7- Efecto del pH sobre la estabilidad de la actividad proteolítica -- 3.2.8- Efecto del pH y la temperatura en la actividad proteolítica de los extractos -- 3.2.9- Efecto de inhibidores en la actividad proteolítica -- 3.2.10- Cromatografías de exclusión molecular -- 3.2.11- Intercambio iónico del EC(Ficus) -- 3.2.12- Determinación de puntos isoeléctricos -- 3.2.13- Hidrólisis de las proteínas del lactosuero -- 3.2.14- Electroforesis en geles de poliacrilamida -- 3.2.15- Zimogramas -- 3.2.16- Fraccionamiento de los productos de hidrólisis -- 3.2.17- Evaluación de la actividad antimicrobiana -- 3.2.18- Cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa (RP-HPLC). 48 3.2.19- Evaluación de la actividad antioxidante -- 3.2.20- Espectrometría de masas -- 3.2.21- Análisis estadístico -- 4- Resultados y discusión -- 4.1- Caracterización de la actividad proteolítica de los extractos -- 4.1.1- Actividad proteolítica de los extractos crudos, efecto de inhibidores y agentes reductores -- 4.1.2- Determinación de la capacidad de coagulación de la leche -- 4.1.3- Efecto del pH y la temperatura en la actividad proteolítica de los extractos -- 4.1.4- Efecto del pH y la temperatura sobre la estabilidad de la actividad proteolítica de los extractos -- 4.2- Características moleculares del extracto crudo de Ficus luschnathiana -- 4.2.1- Evaluación de la ocurrencia de autolisis de las peptidasas del EC(Ficus) -- 4.2.2- Fraccionamiento del EC(Ficus) por cromatografía de exclusión molecular -- 4.2.3- Evaluación de la formación de agregados moleculares dependientes del pH del medio -- 4.2.4- Fraccionamiento del EC(Ficus) por intercambio iónico -- 4.3- Hidrólisis de sueros lácteos -- 4.4- Obtención de péptidos antimicrobianos -- 4.5- Obtención de péptidos antioxidantes -- 4.6- Análisis de las secuencias de los péptidos antioxidantes -- 5- Discusión general -- 6- Conclusiones -- 7- Anexos --I- Características de la extracción y ejemplos de valores de actividad de los extractos crudos -- II- Ecuaciones de las curvas de calibración -- III- Códigos de denominación de aminoácidos -- IV- Portadas de los trabajos publicados -- 8- Referencias125 p.application/pdfesspaUdelar. FQLas obras depositadas en el Repositorio se rigen por la Ordenanza de los Derechos de la Propiedad Intelectual de la Universidad de la República.(Res. Nº 91 de C.D.C. de 8/III/1994 – D.O. 7/IV/1994) y por la Ordenanza del Repositorio Abierto de la Universidad de la República (Res. Nº 16 de C.D.C. de 07/10/2014)info:eu-repo/semantics/openAccessLicencia Creative Commons Atribución - No Comercial - Sin Derivadas (CC - By-NC-ND 4.0)Enzimas proteolíticaLátexLactosueroPéptidos bioactivosActividad proteolítica del látex de plantas indígenas uruguayas: obtención de péptidos antimicrobianos y/o antioxidantesTesis de doctoradoinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionreponame:COLIBRIinstname:Universidad de la Repúblicainstacron:Universidad de la RepúblicaBarros Baez, MiriamCantera, Ana MaríaVilladóniga, CarolinaUniversidad de la República (Uruguay). Facultad de QuímicaDoctor en QuímicaLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-84267http://localhost:8080/xmlui/bitstream/20.500.12008/41890/5/license.txt6429389a7df7277b72b7924fdc7d47a9MD55CC-LICENSElicense_urllicense_urltext/plain; charset=utf-850http://localhost:8080/xmlui/bitstream/20.500.12008/41890/2/license_urla006180e3f5b2ad0b88185d14284c0e0MD52license_textlicense_texttext/html; charset=utf-822711http://localhost:8080/xmlui/bitstream/20.500.12008/41890/3/license_text3bf72aba7589cf23c5101bece94f4503MD53license_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-825790http://localhost:8080/xmlui/bitstream/20.500.12008/41890/4/license_rdf489f03e71d39068f329bdec8798bce58MD54ORIGINALTD_Barros.pdfTD_Barros.pdfapplication/pdf4026238http://localhost:8080/xmlui/bitstream/20.500.12008/41890/1/TD_Barros.pdf17b3867645853e37df30d6fbada551caMD5120.500.12008/418902024-09-13 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