En los últimos años las biotransformaciones se han vuelto parte importante de la química sintética dadas las grandes ventajas que se le conocen, no solo por las condiciones suaves de reacción requeridas y la gran versatilidad que presentan; sino también por su alta quimio, regio- y estereoselectividad. Esto permite realizar transformaciones específicas sobre los sustratos y obtener productos que muchas veces no son accesibles por métodos clásicos, y principalmente permite obtener compuestos enantioméricamente puros de gran interés a nivel industrial. Entre las principales transformaciones en química orgánica se encuentran las reacciones de oxidación, lo cual ha impulsado el estudio de las oxidorreductasas como biocatalizadores de interés, y es dentro de este grupo que se encuentran las dioxigenasas tipo Rieske con las que se trabajó en esta tesis. Estas enzimas catalizan el primer paso para la degradación de compuestos aromáticos en bacterias, cuando son utilizados como fuente de carbono y energía. En 1968 el grupo del Dr. Gibson describió la actividad dioxigenasa en una cepa mutante de Pseudomonas putida y a partir de ese momento comenzaron los estudios de esta vasta familia de enzimas, a la cual se le reconoció un gran potencial en química sintética siendo utilizadas hasta el día de hoy para la producción de materiales de partida quirales. De los diferentes miembros de dicha familia de enzimas, el sistema Tolueno Dioxigenasa (TDO) es uno de los más utilizados a escala preparativa, pero no el más estudiado en cuanto a estructura del sitio activo y posible alteración de su regio- o estereoselectividad. En esta tesis se abordó el estudio de tales aspectos, seleccionando por alineamiento de secuencias aquellos residuos del sitio activo identificados como claves en otras enzimas tipo Rieske, como Naftaleno y Bifenilo Dioxigenasas (NDO y BPDO). El desarrollo de cuatro variantes de TDO (Q215A, I324F, T365N y F366V) permitió evaluar la influencia de estos residuos en las propiedades de la enzima, identificando algunos importantes para la quimio- y estereoselectividad de la reacción de dihidroxilación. A su vez, se desarrolló el primer 10 modelo computacional del sitio activo de TDO, lo cual constituye una herramienta de suma importancia, tanto para la comprensión de los resultados obtenidos como para el desarrollo de trabajos futuros en el área. Por otra parte, se reportan aquí nuevas actividades para las dioxigenasas tipo Rieske.