La comunicación intercelular está mediada por diversas macromoléculas, incluidos los RNAs, que pueden transportarse como carga dentro de vesículas extracelulares (EVs). Además, nuestro laboratorio demostró recientemente que los RNAs extracelulares desnudos pueden internalizarse espontáneamente en distintos tipos celulares, logrando incluso acceder al citosol de las células receptoras, en un proceso que hemos denominado "gimnosis fisiológica". Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares que regulan la internalización y el escape endosomal de los RNAs encapsulados en EVs siguen sin comprenderse completamente, y los mecanismos subyacentes a la gimnosis fisiológica son enteramente desconocidos. En este estudio, utilizamos microscopía confocal y microscopía de lámina de luz (LLSM) en células vivas para analizar la dinámica de EVs teñidas en su membrana y purificadas cromatográficamente, permitiendo el seguimiento en tiempo real de su tráfico desde el exterior al interior celular. Adicionalmente, generamos líneas celulares estables que expresan proteínas lisosomales fluorescentes para investigar las interacciones 4D de EV con (endo)lisosomas mediante imágenes LLSM en vivo. La marcación fluorescente de exRNAs (vesiculares y no vesiculares) reveló rutas de escape endosomal tanto para RNAs encapsulados en EV como para exRNAs desnudos, siendo estos últimos más eficientes en nuestros ensayos. La ablación genética de proteínas específicas de unión a RNA potenció el escape endosomal de exRNAs desnudos, sugiriendo que la gimnosis fisiológica podría ser un proceso regulado. Cabe destacar que el escape endosomal se considera un cuello de botella crítico en terapias basadas en RNAs, resaltando la relevancia traslacional de esclarecer estos mecanismos.