Las bacterias psicrótrofas son capaces de crecer a bajas temperaturas (4-7 °C), gracias a su elevado metabolismo, predominantemente lipo-proteolítico. Su importancia en la leche y productos lácteos, radica en la habilidad de producción de enzimas extracelulares, principalmente proteasas estables al calor, que permanecen activas en un amplio rango de temperaturas. El objetivo de este trabajo, fue caracterizar la producción de enzimas proteolíticas termoestables de bacterias psicrótrofas, aisladas de leche de tanque de cuatro establecimientos lecheros de la región litoral-norte de Uruguay. Para ello se conformó un cepario de 167 aislamientos los cuales se clasificaron de acuerdo a su capacidad de hidrolizar la caseína. Los aislamientos proteolíticos se identificaron mediante secuenciación del gen que codifica el ARNr 16S. La producción de enzima fue evaluada utilizando azocaseína como sustrato, antes y después del tratamiento térmico. También se realizó en estos aislamientos la búsqueda del gen aprX, que codifica una metaloproteasa alcalina, principal responsable del deterioro de la leche. Por otra parte, se evaluó la capacidad de coagulación de la leche comercial entera y descremada a temperatura ambiente y de refrigeración. En los aislamientos con mayor producción de enzimas se determinó el rango de actividad a diferentes pH y temperaturas. En relación a los resultados, el 33% de los aislamientos psicrótrofos mostraron actividad proteolítica y el 54,5 % de estos produjeron enzimas termoestables. Una gran variedad de géneros y especies de bacterias psicrótrofas fue identificada. Las especies más frecuentemente aisladas corresponden a psicrótrofos cuyo origen puede ser ambiental (Gram negativos y positivos). Dentro de los Gram negativos, el género Pseudomonas spp. fue el aislado con mayor frecuencia, representado por las especies P. aeruginosa y P. fluorescens. Otras especies de Gram negativos correspondieron a Serratia liquefaciens, Serratia marcescens y Stenotrophomonas spp. Se destacaron por sus mayores títulos de producción de enzimas, actividad enzimática en un amplio rango de pH y estabilidad térmica alta, los aislamientos de Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens y Serratia liquefaciens. Las enzimas producidas por estos aislamientos mostraron mayor actividad enzimática a pH 8 y a temperatura de 37 °C, lo que podría indicar la producción de proteasas alcalinas termoestables. El gen aprX se detectó únicamente en la cepa de Pseudomonas fluorescens 160A. Varios aislamientos presentaron enzimas con capacidad de coagular la leche comercial a temperatura ambiente y de refrigeración, lo que, sumado a la termoestabilidad de estas enzimas, dan cuenta del riesgo potencial de alteración que tendría la leche pasteurizada y UHT durante su almacenamiento y distribución.