La leptospirosis es una zoonosis ampliamente distribuida a nivel mundial que es causada por distintas especies patógenas del género Leptospira. En Uruguay, el diagnóstico en animales durante muchos años estuvo basado en la técnica serológica de aglutinación microscópica (MAT). El objetivo del presente estudio fue establecer el acuerdo entre la técnica serológica, el cultivo microbiológico y el método molecular de amplificación del gen lipL32 por PCR en muestras provenientes de rodeos con sintomatología clínica compatible con leptospirosis bovina. Se recolectaron muestras de 44 establecimientos pertenecientes a 13 departamentos del Uruguay, los que comprendían tanto sistemas lecheros como carniceros. Se extrajeron 860 muestras de suero y orina; las primeras fueron analizadas por MAT y las segundas fueron inoculadas en medio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) con 5-fluorouracilo (5-FU) en campo y analizadas por PCR. El 95 % de los establecimientos (42/44) y 39 % de los animales (339/860) fueron reactivos al MAT con título ≥200. El 19 % de las orinas (167/884) fueron positivas por PCR y se obtuvieron 33 cultivos positivos para especies patógenas de Leptospira. Finalmente, se lograron purificar y obtener 25 aislamientos que fueron identificados mediante la combinación de métodos serológicos y moleculares, que dieron como resultado 19 aislamientos de L. interrogans serogrupo Pomona serovar Kennewicki, 2 de L. borgpetersenii serogrupo Sejroe serovar Hardjo y 4 de L. noguchii serogrupos Autumnalis (n=2), Australis (n=1) y Pyrogenes (n=1). Se estudió la concordancia entre los diferentes métodos y los valores de Kappa indicaron que existe concordancia leve a aceptable entre el método indirecto y los directos (k= 0,26 entre MAT y PCR y k= 0,08 entre MAT y cultivo) y leve entre los métodos directos (k= 0,16 entre PCR y cultivo). Las pruebas diagnósticas reflejaron poseer diferentes ventajas, por lo que se considera que las tres herramientas deben ser aplicadas en Uruguay tanto con fines diagnósticos como en investigaciones epidemiológicas.