La presente Tesis está basada en 5 estudios, en los que se investigaron aspectos endócrino-moleculares, histológicos y bioquímicos involucrados con la remodelación de la matriz extracelular (MEC) y relajación del cérvix ovino. Los estudios se realizaron durante el ciclo estral en estación reproductiva y durante el anestro estacional en ovejas inducidas a ovular. Se utilizaron 46 ovejas Corriedale y se realizaron tres experimentos: 1º) Ovejas ciclando en estación reproductiva sacrificadas los días 1 (n=7), 6 (n=6) o 13 (n=7) de detectado estro (Estudios I, II y III). 2º) Ovejas en anestro estacional tratadas con GnRH para inducir la ovulación con o sin progesterona (P4) previa y sacrificadas sin tratamiento (n=4), inmediatamente luego del tratamiento con P4 (n=4) y un día luego del tratamiento con GnRH (n=4) o P4+GnRH (n=3) (Estudios IV y V). 3º) Ovejas en anestro tratadas con P4+GnRH para inducir la ovulación y sacrificadas los días 1 (n=6) o 5 (n=5) después del bolo de GnRH (Estudios IV y V). En los 3 experimentos se obtuvieron muestras de sangre para determinaciones de 17β-estradiol (E2) y P4 por RIA y al sacrificio se obtuvieron muestras de cérvix craneal y caudal para estudios moleculares, histológicos y bioquímicos. El transcripto del receptor de estrógenos subtipo α (ARNm REα) fue determinado por hibridización en solución y las concentraciones de receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP) por ensayos de unión (Estudios I y IV). Los REα, los receptores de LH (RLH) y de oxitocina (ROx) y la ciclooxigenasa-2 (COX-2) se localizaron y cuantificaron en los epitelios y estromas cervicales por inmunohistoquímica (Estudio II). Las metaloproteinasas de la MEC -2 y -9 (MMP-2 y MMP-9) fueron identificadas y localizadas por inmunhistoquímica y las formas Latente y Activa fueron determinadas por zimografía en SDS-PAGE. La distribución de las fibras y la concentración de colágeno se determinaron por la técnica tricrómica de van Giesson y por la cuantificación espectrofotométrica de hidroxiprolina, respectivamente (Estudios III y V). Durante el ciclo estral en estación reproductiva, se encontraron mayores concentraciones cervicales de ARNm REα, RE y RP alrededor de la ovulación luego del pico preovulatorio de E2 y menores concentraciones en fase lútea a predominio de P4 (Estudio I). Los niveles de expresión de REα, RLH, ROx y COX-2 fueron mayores en los epitelios que en los estromas cervicales: para REα la mayor expresión se encontró en epitelios luminales alrededor de la ovulación, mientras que para RLH, ROx y COX-2 la mayor expresión se encontró en fase lútea tardía (Estudio II). La MMP-2 fue predominante en cérvix ovino, ya que MMP-9 solo fue detectada en menos del 9% de las muestras. El área ocupada por las fibras de colágeno y la concentración de colágeno disminuyeron alrededor de la ovulación, asociadas al aumento de 10 a 20 veces en la concentración y en la actividad de la MMP-2, producida por los fibroblastos del estroma (Estudio III). Se sugiere que los E preovulatorios, a través del REα epitelial, dirigen la cascada de eventos que llevan al incremento de la desagregación y de la degradación enzimática del colágeno al estro, demostrando la coexistencia de estos dos procesos en los mecanismos de remodelación de la MEC. Durante el anestro estacional, con concentraciones basales de E2 y P4 circulantes, el cérvix mostró expresión constitutiva de ARNm REα, RE, RP y MMP-2, que se manifestó en forma diferencial en las zonas craneal y caudal (Estudios IV y V). En el cérvix craneal, las concentraciones de ARNm REα, RE, RP y MMP-2 mostraron el efecto estimulatorio de E2 inducido por la GnRH y el efecto inhibitorio de la P4 y fueron mayores alrededor de la ovulación inducida que en fase lútea temprana. Sin embargo, en el cérvix caudal los niveles fueron menores y no fueron afectados por los tratamientos, sugiriendo que el anestro estacional condiciona la capacidad de respuesta a los E y el potencial colagenolítico de MMP-2, en forma dependiente de la zona cervical (Estudios IV y V). Al igual que en ciclo estral, la MMP-2 fue predominante en cérvix ovino. La concentración de colágeno fue menor y la actividad de la MMP-2 fue mayor alrededor de la ovulación inducida que en la fase lútea temprana, sugiriendo que el aumento de los E preovulatorios inducen la degradación del colágeno a través del estímulo de la actividad enzimática de la MMP-2 (Estudio V), a diferencia de lo encontrado durante el ciclo estral, donde el estímulo fue sobre la síntesis y la actividad de MMP-2. Se sugiere que el tratamiento con GnRH y P4 previa para inducir la ovulación en anestro, reproduce parcialmente los mecanismos de degradación del colágeno descritos en ovejas ciclando. En todos los estudios realizados durante el ciclo estral en estación reproductiva y el ciclo inducido en anestro estacional se encontraron marcadas diferencias histomorfológicas y/o en la expresión de RE, RP, RLH, ROx, COX-2 y MMP-2 entre cérvix craneal y caudal, lo que refleja distintos roles fisiológicos para estas zonas cervicales. En conclusión, se demuestra que la mayor capacidad de respuesta a los E del cérvix ovino alrededor de la ovulación se asocia con mayor actividad colagenasa y mayor desagregación de las fibras y degradación de colágeno, tanto en ciclo estral natural como inducido en anestro estacional. Se infiere que la desagregación de las fibras y degradación de colágeno estimuladas directa o indirectamente por los E, están involucradas en la remodelación de la MEC y contribuyen a la relajación, dilatación y aumento de la penetrabilidad del cérvix al momento de la ovulación.

This thesis is based on five studies, in which, endocrine-molecular, histological and biochemical aspects involved in the remodeling of extracellular matrix (ECM) and relaxation of the cervix were investigated. The studies were conducted in ewes during the estrous cycle in the breeding season and in ewes induced to ovulate during seasonal anestrus. Forty six Corriedale ewes were used to perform three experiments: 1) Cycling sheep during the breeding season were sacrificed on days 1 (n=7), 6 (n=6) or 13 (n=7) after the estrus detection (Studies I, II and III). 2). Seasonal anestrus sheep treated with GnRH with or without progesterone (P4) priming to induce the ovulation were also used and were sacrificed without treatment (n=4), when the P4 was removed (n=4) or one day after the GnRH bolus injection with (n=3) or without (n=4) P4 priming (Studies IV and V). 3) Seasonal anestrous ewes treated with the same P4+GnRH treatment used in the experiment 2 were used and were sacrificed on days 1 (n=6) or 5 (n=5) after GnRH bolus injection (Studies IV and V). In the 3 experiments, blood samples were collected for estradiol-17β (E2) and P4 determinations by RIA. Samples of cranial and caudal cervix were obtained at sacrifice for molecular, histological and biochemical studies. The transcript of estrogen receptor α (ERα mRNA) was determined by solution hybridization. Estrogen and P4 receptors (ER and PR, respectively) concentrations were determined by binding assays (Studies I and IV). The ERα, LH (LHR) and oxytocin (OxR) receptors and cyclooxygenase-2 (COX-2) in cervical epithelia and stroma were located and quantified by immunohistochemistry (Study II). The ECM metalloproteinases -2 and -9 (MMP-2 and MMP-9) were identified and located by immunohistochemistry and the Latent and Active forms were determined by SDS-PAGE zymography. The collagen fibers distribution and the collagen concentration were determined by van Giesson trichrome technique and hydroxyproline spectrophotometric quantification, respectively (Study III and V). During the estrous cycle in the breeding season, higher cervical ERα mRNA, ER and PR concentrations around ovulation -after the E2 preovulatory peak- and lower concentrations during the luteal phase –under P4 predominance- were found (Study I). The levels of expression of ERα, LHR, OxR and COX-2 were greater in the cervical epithelia than in the stroma: increased expression of REα was found in luminal epithelia around the ovulation, while the highest expression for LHR, OxR and COX-2 was found during the late luteal phase (Study II). The MMP-2 was the predominant gelatinase in cervix since that the MMP-9 was only detected in less than 9% of the samples. The area occupied by collagen fibers and the collagen concentration decreased around ovulation, associated with 10 to 20 times increased in the MMP-2 concentration and activity, produced by stromal fibroblasts (Study III). Thus, the preovulatory E, acting through the epithelial ERα, trigger the cascade of events that induce the increase in collagen disaggregation and enzymatic degradation at estrus, showing the coexistence of these two processes in ECM remodeling mechanisms. During the seasonal anoestrus, with basal levels of circulating E2 and P4, the ovine cervix showed a constitutive expression of ERα mRNA, ER PR and MMP-2, which are expressed differentially in the cranial and caudal zones (Studies IV and V). In the cranial cervix, the concentrations of ERα mRNA, ER, PR and MMP-2 showed the stimulatory effect of E2 induced by GnRH treatment and the inhibitory effect of P4, and were higher around the induced ovulation than in the early luteal phase. However, in the caudal cervix, these levels were lower than in the cranial zone and were not affected by the treatments, suggesting that the seasonal anoestrus affects the capacity of response to the E and the collagenolytic potential of MMP-2 dependently in the cervical zone (Studies IV and V). As during the estrous cycle, MMP-2 was the predominant gelatinase in the cervix of sheep in seasonal anestrus. The collagen concentration was lower and the activity of MMP-2 was higher around the induced ovulation than in the early luteal phase, suggesting that the increase of preovulatory E, induce the collagen degradation by stimulating the MMP-2 activity (Study V), while the increase of MMP-2 -E dependent- during the estrous cycle was demonstrated on both the synthesis and activity. It is suggested that the P+GnRH treatment to induce ovulation in anestrus ewes partially reproduces the collagen degradation mechanisms described in cycling ewes. In the studies conducted during the natural estrous cycle in the breeding season as well as in the induced estrous cycle in the seasonal anestrus, histomorphologic differences and/or in the levels of ER, PR, RLH, ROx, COX-2 and MMP-2 expression were demonstrated between cranial and caudal cervix, reflecting their different physiological roles. In conclusion, greater capacity of response to E around ovulation was demonstrated in the ewe cervix in natural estrous cycle as well as induced estrous cycle in seasonal anestrus. This greater capacity of response to E is associated with increased collagenase activity and greater collagen fibers disaggregation and degradation. It is inferred that the E, directly or indirectly, induce the collagen fibers disaggregation and degradation, which are involved in the ECM remodeling and contribute to relaxation, dilatation and increased penetration of the cervix around ovulation.