Integración de la minería genómica y la metabolómica para descifrar el potencial de producción de metabolitos bioactivos en cepas de Streptomyces de Uruguay
Supervisor(es): Siri, María Inés - Moyna, Guillermo - Pianzzola, María Julia
Resumen:
El género Streptomyces es reconocido por su versatilidad metabólica y capacidad de producción de metabolitos bioactivos. A pesar de décadas de investigación, se siguen descubriendo nuevos productos naturales derivados de Streptomyces, lo que destaca la importancia de continuar explorando este género en busca de compuestos con potencial terapéutico y aplicaciones biotecnológicas. El presente trabajo de tesis permitió la caracterización de una colección de 235 cepas de Streptomyces aisladas en Uruguay en cuanto a su potencial de producción de metabolitos bioactivos. En primer lugar, se determinaron los compuestos fitotóxicos responsables de la patogenicidad en papa de diferentes especies de Streptomyces a partir de los perfiles metabolómicos por 1H RMN de los sobrenadantes de cultivo de algunas cepas de Streptomyces de la colección. Se estableció un modelo metabolómico capaz de clasificar las cepas en función de su fitotoxicidad, estableciendo correlaciones entre los perfiles metabólicos y las relaciones filogenéticas de las especies de Streptomyces patógenas. Por otro lado, se evaluaron otras actividades de interés para lo cual se optimizaron nuevas metodologías de screening como la actividad nematicida y de promoción de crecimiento vegetal. Se identificaron 17 cepas de Streptomyces con actividad nematicida frente a C. elegans. Por otra parte, se identificaron varias cepas con propiedades de actividad promotora de crecimiento vegetal, como la producción de compuestos que solubilizan el fósforo, de sideróforos y de hormonas vegetales. Posteriormente, se profundizó en la determinación de los metabolitos responsables de estas actividades en cinco de estas cepas abordando un enfoque genómico y metabolómico.En cuanto a los estudios de minería genómica, se encontraron varios grupos de genes biosintéticos (BGCs) de diversos tipos entre las cepas analizadas, donde la mayoría presentan nula o muy baja similitud con otros BGCs reportados, evidenciando la existencia de BGCs desconocidos. El estudio metabolómico se basó en el uso de cromatografía líquida acoplada a detector de masas en tándem y plataformas de análisis asociadas a bases de datos para determinar los compuestos presentes en las muestras. Los resultados obtenidos permitieron contar con posibles candidatos, y además revelaron una alta proporción de estructuras químicas desconocidas. Por último, se realizó un análisis genético funcional en una de las cepas con actividad nematicida para evaluar el rol de la antimicina como compuesto responsable de su actividad. Para ello, se construyó un mutante knock out del gen antC mediante la estrategia CRISPR-Cas9. No se detectaron diferencias claras entre el fenotipo nematicida de la cepa salvaje y mutante, por lo que se sugiere la presencia de otros compuestos responsables de la actividad. La ejecución de esta tesis fue clave para la implementación de nuevas herramientas de análisis metabolo genómicos que serán de gran utilidad para futuros proyectos. Además, se cuenta con un repertorio de cepas bioactivas caracterizadas y con un gran volumen de datos sobre sus perfiles metabólicos y genómicos que sugieren la existencia de nuevas moléculas sobre las cuales continuar profundizando.
2023 | |
Metabolómica Genómica Streptomyces |
|
Español | |
Universidad de la República | |
COLIBRI | |
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dc.description.tableofcontents.es.fl_txt_mv | CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN GENERAL. 1.1 Los actinomicetos y el género Streptomyces. 1.2 Productos naturales del género Streptomyces. 1.3 Principales clases de productos naturales producidos por Streptomyces y su biosíntesis. 1.4 Un nuevo concepto: metabolismo especializado. 1.5 El particular genoma de los actinomicetos. 1.6 Estrategias para el descubrimiento de nuevos metabolitos especializados de Streptomyces. 1.6.1 Minería genómica. 1.6.2 Metabolómica. 1.6.3 Integración metabologenómica. 1.7 Antecedentes de trabajo y justificación. 1.8 Objetivos y descripción de la tesis. 1.8.1 Objetivo general. 1.8.2 Objetivos específicos:. 1.8.3 Descripción de la Tesis. CAPÍTULO 2: CARACTERIZACIÓN DE COMPUESTOS FITOTÓXICOS PRODUCIDOS POR CEPAS DE STREPTOMYCES PATÓGENAS MEDIANTE UN ABORDAJE METABOLÓMICO Y FILOGENÉTICO. 2.1 Introducción. 2.2 Materiales y métodos. 2.2.1 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo. 2.2.2 Bioensayo de fitotoxicidad en rabanito. 2.3 Análisis por HPLC-UV. 2.2.4 Análisis filogenético de las cepas. 2.2.5 Detección molecular de genes específicos de DMSN y TXT. 2.2.6 Espectroscopía por RMN. 2.2.7 Análisis estadístico multivariado. 2.3 Resultados. 2.3.1 La mayoría de los sobrenadantes de las cepas de Streptomyces patógenas presentaron actividad fitotóxica. 2.3.2 Correlación de la fitotoxicidad con fitotoxinas ya conocidas producidas por Streptomyces. 2.3.3 Conectando el perfil metabólico con el potencial patogénico y la filogenia de las cepas. 2.4 Discusión. CAPÍTULO 3: EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD NEMATICIDA Y DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO VEGETAL EN CEPAS DE STREPTOMYCES AISLADAS EN URUGUAY. 3.1 Introducción. 3.1.1 Actividad antiparasitaria. 3.1.2 Actividad de promoción de crecimiento vegetal. 3.2 Materiales y métodos. 3.2.1 Optimización de las condiciones del ensayo de actividad nematicida. 3.2.2 Metodología optimizada para la evaluación de actividad nematicida en sobrenadantes de cultivo. 3.2.3 Pre-screening de actividad nematicida. 3.2.4 Screening de actividad nematicida. 3.2.5 Identificación molecular de las cepas con actividad nematicida. 3.2.6 Preparación de extractos orgánicos y acuosos a partir de sobrenadantes de cepas seleccionadas con actividad nematicida. 3.2.7 Screening de propiedades de promoción de crecimiento vegetal in vitro. 3.3 Resultados. 3.3.1 Optimización de las condiciones del ensayo de actividad nematicida. 3.3.2 Selección de cepas de Streptomyces productoras de compuestos con actividad nematicida. 3.3.3 Actividad nematicida en extractos acuosos y orgánicos de las cepas seleccionadas. 3.3.4 Identificación molecular de las cepas de Streptomyces seleccionadas con actividad nematicida. 3.3.5 Screening de propiedades directas de PCV en cepas de Streptomyces seleccionada. 3.4 Discusión. CAPÍTULO 4: ESTUDIO METABOLOGENÓMICO DE UNA SELECCIÓN DE CEPAS DE STREPTOMYCES SPP. BIOACTIVAS. 4.1 Introducción. 4.1.1 Minería de genomas. 4.1.2 Minería metabolómica. 4.2 Materiales y métodos. 4.2.1 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo. 4.2.2 Análisis genómico. 4.2.3 Análisis metabolómico. 4.3 Resultados. 4.3.1 Secuenciación del genoma completo de cepas de Streptomyces seleccionadas 111 4.3.2 Ensamblaje de los genomas. 4.3.3 Anotación de los genomas ensamblados. 4.3.4 Identificación y relaciones taxonómicas de las cepas. 4.3.5 Minería genómica. 4.3.6 Análisis de BGCs desde una perspectiva global: BiG-SCAPE. 4.3.7 Análisis metabolómico: construcción de redes moleculares. 4.3.8 Compuestos bioactivos candidatos en base a coincidencias obtenidas con bilbliotecas de GNPS y su conexión con sus BGCs. 4.3.9 Búsqueda de compuestos nematicidas en la base de datos del NPAtlas. 4.4 Discusión. CAPÍTULO 5: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD NEMATICIDA DE ANTIMICINAS MEDIANTE LA CONSTRUCCIÓN DE UN MUTANTE KNOCK-OUT. 5.1 Introducción. 5.2 Materiales y métodos. 5.2.1 Búsqueda de antimicinas en la cepa MAI 2237. 5.2.2 Construcción del mutante de Streptomyces MAI 2237ΔantC utilizando la metodología CRISPR-Cas9. 5.2.3 Evaluación de la actividad nematicida frente a C. elegans en la cepa Streptomyces MAI 2237 y el mutanteΔantC. 5.3 Resultados. 5.3.1 Análisis del BGC de antimicina de la cepa MAI 2237 y verificación de su expresión. 5.3.2 Evaluación de la capacidad de conjugación y sensibilidad a antibióticos de la cepa a modificar. 5.3.3 Construcción del plásmido pCRISPR con los elementos necesarios para realizar la edición genética. 5.3.4 Conjugación y edición genómica de MAI 2237. 5.3.5 Curado del plásmido. 5.3.6 Evaluación de la actividad nematicida de la cepa MAI 2237ΔantC. 5.4 Discusión - CAPÍTULO 6: CONSIDERACIONES FINALES Y PERSPECTIVAS - BIBLIOGRAFÍA - ANEXOS |
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CAPÍTULO 2: CARACTERIZACIÓN DE COMPUESTOS FITOTÓXICOS PRODUCIDOS POR CEPAS DE STREPTOMYCES PATÓGENAS MEDIANTE UN ABORDAJE METABOLÓMICO Y FILOGENÉTICO. 2.1 Introducción. 2.2 Materiales y métodos. 2.2.1 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo. 2.2.2 Bioensayo de fitotoxicidad en rabanito. 2.3 Análisis por HPLC-UV. 2.2.4 Análisis filogenético de las cepas. 2.2.5 Detección molecular de genes específicos de DMSN y TXT. 2.2.6 Espectroscopía por RMN. 2.2.7 Análisis estadístico multivariado. 2.3 Resultados. 2.3.1 La mayoría de los sobrenadantes de las cepas de Streptomyces patógenas presentaron actividad fitotóxica. 2.3.2 Correlación de la fitotoxicidad con fitotoxinas ya conocidas producidas por Streptomyces. 2.3.3 Conectando el perfil metabólico con el potencial patogénico y la filogenia de las cepas. 2.4 Discusión. CAPÍTULO 3: EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD NEMATICIDA Y DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO VEGETAL EN CEPAS DE STREPTOMYCES AISLADAS EN URUGUAY. 3.1 Introducción. 3.1.1 Actividad antiparasitaria. 3.1.2 Actividad de promoción de crecimiento vegetal. 3.2 Materiales y métodos. 3.2.1 Optimización de las condiciones del ensayo de actividad nematicida. 3.2.2 Metodología optimizada para la evaluación de actividad nematicida en sobrenadantes de cultivo. 3.2.3 Pre-screening de actividad nematicida. 3.2.4 Screening de actividad nematicida. 3.2.5 Identificación molecular de las cepas con actividad nematicida. 3.2.6 Preparación de extractos orgánicos y acuosos a partir de sobrenadantes de cepas seleccionadas con actividad nematicida. 3.2.7 Screening de propiedades de promoción de crecimiento vegetal in vitro. 3.3 Resultados. 3.3.1 Optimización de las condiciones del ensayo de actividad nematicida. 3.3.2 Selección de cepas de Streptomyces productoras de compuestos con actividad nematicida. 3.3.3 Actividad nematicida en extractos acuosos y orgánicos de las cepas seleccionadas. 3.3.4 Identificación molecular de las cepas de Streptomyces seleccionadas con actividad nematicida. 3.3.5 Screening de propiedades directas de PCV en cepas de Streptomyces seleccionada. 3.4 Discusión. CAPÍTULO 4: ESTUDIO METABOLOGENÓMICO DE UNA SELECCIÓN DE CEPAS DE STREPTOMYCES SPP. BIOACTIVAS. 4.1 Introducción. 4.1.1 Minería de genomas. 4.1.2 Minería metabolómica. 4.2 Materiales y métodos. 4.2.1 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo. 4.2.2 Análisis genómico. 4.2.3 Análisis metabolómico. 4.3 Resultados. 4.3.1 Secuenciación del genoma completo de cepas de Streptomyces seleccionadas 111 4.3.2 Ensamblaje de los genomas. 4.3.3 Anotación de los genomas ensamblados. 4.3.4 Identificación y relaciones taxonómicas de las cepas. 4.3.5 Minería genómica. 4.3.6 Análisis de BGCs desde una perspectiva global: BiG-SCAPE. 4.3.7 Análisis metabolómico: construcción de redes moleculares. 4.3.8 Compuestos bioactivos candidatos en base a coincidencias obtenidas con bilbliotecas de GNPS y su conexión con sus BGCs. 4.3.9 Búsqueda de compuestos nematicidas en la base de datos del NPAtlas. 4.4 Discusión. CAPÍTULO 5: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD NEMATICIDA DE ANTIMICINAS MEDIANTE LA CONSTRUCCIÓN DE UN MUTANTE KNOCK-OUT. 5.1 Introducción. 5.2 Materiales y métodos. 5.2.1 Búsqueda de antimicinas en la cepa MAI 2237. 5.2.2 Construcción del mutante de Streptomyces MAI 2237ΔantC utilizando la metodología CRISPR-Cas9. 5.2.3 Evaluación de la actividad nematicida frente a C. elegans en la cepa Streptomyces MAI 2237 y el mutanteΔantC. 5.3 Resultados. 5.3.1 Análisis del BGC de antimicina de la cepa MAI 2237 y verificación de su expresión. 5.3.2 Evaluación de la capacidad de conjugación y sensibilidad a antibióticos de la cepa a modificar. 5.3.3 Construcción del plásmido pCRISPR con los elementos necesarios para realizar la edición genética. 5.3.4 Conjugación y edición genómica de MAI 2237. 5.3.5 Curado del plásmido. 5.3.6 Evaluación de la actividad nematicida de la cepa MAI 2237ΔantC. 5.4 Discusión - CAPÍTULO 6: CONSIDERACIONES FINALES Y PERSPECTIVAS - BIBLIOGRAFÍA - ANEXOS224 p. + anexosapplication/pdfesspaUdelar. FQ : PEDECIBALas obras depositadas en el Repositorio se rigen por la Ordenanza de los Derechos de la Propiedad Intelectual de la Universidad de la República.(Res. Nº 91 de C.D.C. de 8/III/1994 – D.O. 7/IV/1994) y por la Ordenanza del Repositorio Abierto de la Universidad de la República (Res. Nº 16 de C.D.C. de 07/10/2014)info:eu-repo/semantics/openAccessLicencia Creative Commons Atribución - No Comercial - Sin Derivadas (CC - By-NC-ND 4.0)MetabolómicaGenómicaStreptomycesIntegración de la minería genómica y la metabolómica para descifrar el potencial de producción de metabolitos bioactivos en cepas de Streptomyces de UruguayTesis de doctoradoinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionreponame:COLIBRIinstname:Universidad de la Repúblicainstacron:Universidad de la RepúblicaCroce Paullier, Valentina MaríaSiri, María InésMoyna, GuillermoPianzzola, María JuliaUniversidad de la República (Uruguay). Facultad de QuímicaDoctor en QuímicaLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-84267http://localhost:8080/xmlui/bitstream/20.500.12008/41335/5/license.txt6429389a7df7277b72b7924fdc7d47a9MD55CC-LICENSElicense_urllicense_urltext/plain; charset=utf-850http://localhost:8080/xmlui/bitstream/20.500.12008/41335/2/license_urla006180e3f5b2ad0b88185d14284c0e0MD52license_textlicense_texttext/html; charset=utf-814674http://localhost:8080/xmlui/bitstream/20.500.12008/41335/3/license_text6eed504571858d3e58aeed5ad67e191aMD53license_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-825790http://localhost:8080/xmlui/bitstream/20.500.12008/41335/4/license_rdf489f03e71d39068f329bdec8798bce58MD54ORIGINALTD_Croce.pdfTD_Croce.pdfapplication/pdf8130534http://localhost:8080/xmlui/bitstream/20.500.12008/41335/1/TD_Croce.pdf0136670de6cea578b5c6641a17f46655MD5120.500.12008/413352023-11-21 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